scale-X™ 固定床生物反应器悬浮培养工艺

摇瓶工艺转移至 scale-X hydro 固定床生物反应器，以使用悬浮驯化的HEK293细胞进行腺病毒生产

应用笔记

Rimenys Carvalho, Tania Pereira Chilima, Cédric Meeüs, Emilie Gateau, Maria Ferraiuolo, Alessia Noto.

摘要

基于贴壁培养的病毒载体传统生产技术的可放大性限制推动了在搅拌罐生物反应器（STR）中进行悬浮培养的趋势。虽然搅拌罐生物反应器可比典型的固定床生物反应器提供更多的细胞，但高细胞密度并不总是一种可行的方式，转染效率和特异性产率都会降低。使用结构化设计的新型固定床（FB）生物反应器正被用于解决这些挑战，其可在实现高细胞密度培养的同时，确保优越的特异性细胞产率^[1]。这些生物反应器可以适应悬浮和贴壁细胞系培养。 

本文介绍了一项概念验证研究，以生产基于腺病毒载体的COVID-19疫苗。研究使用适应悬浮培养的HEK293细胞系（ReiCells），在scale-X™ hydro生物反应器（2.4m²细胞生长面积）中培养。结果表明，与摇瓶对照组相比，结构化固定床生物反应器成功捕获了细胞，实现可再现的细胞生长，同时培养基消耗更低，特异性产率更高。这些结果证明了固定床生物反应器作为贴壁和悬浮细胞培养平台的实用性。

简介

基因治疗(GT)和疫苗开发人员在生产技术选择过程中往往面临着一定的限制，因为现有的可放大技术通常是专门为贴壁或悬浮细胞培养设计的。在基因治疗领域，传统的贴壁培养技术已经无法应对病毒载体产能的需求。这鼓励了各家公司在搅拌罐生物反应器中转向基于悬浮的培养，因为这是相对成熟、灵活且可规模放大的解决方案。然而，相比贴壁技术，采用搅拌罐生物反应器可能存在一些缺点 (例如较低的特异性细胞产率)。  

在固定床生物反应器中进行的贴壁细胞培养依赖于细胞固定至织物基质。传统固定床生物反应器的可放大性受到细胞分布不均匀的限制。  

图1：scale-X结构化固定床设计，包括卷式PET纤维和用于培养基流动的间隔层

图2：scale-X  生物反应器产品线的可用规模

scale-X™ 生物反应器 (Univercells Technologies)  - 一种新型结构化卷式固定床生物反应器 - 的问世，为细胞生长以及氧气和营养物质的分配提供了一个均匀的环境。  

此外，由于细胞被固定在结构化的基质中，它们得到了适当的保护，以免受叶轮区和循环区剪切的影响。这些生物反应器中高度压实的设计，可在60 L生物反应器中容纳高达600 m²的细胞生长面积。  

Scale-X生物反应器提供多种尺寸选择，以支持从小规模概念验证到商业化生产的工艺开发和制造。该系列产品旨在通过保持不同规模条件下相同的关键操作参数(如固定床压实、表面 - 体积比和KLa)，而为细胞提供相同的微环境。  

对于使用转染和感染工艺的基于贴壁细胞的产品，scale-X生物反应器的设计已被证明可以显著提高细胞密度和特异性产率。在本文中，我们探索了scale-X hydro生物反应器在HEK293细胞悬浮培养工艺中的应用。从这些实验中获得的经验将推动scale-X生物反应器作为病毒生产双重平台的开发。  

图3：scale-X hydro生物反应器系统 (2.4 m² 细胞生长面积)  

材料、方法和设备

本研究使用的生产工艺包括5个操作步骤：(1)细胞接种、(2)细胞生长、(3)病毒感染、(4)腺病毒生产以及(5)细胞裂解(图4)。

细胞生长和病毒生产

生产的载体是ReiThera专有的非复制性大猩猩腺病毒载体(GRAd)，目前正在进行抗COVID-19疫苗的临床开发。该载体使用悬浮驯化过的HEK293细胞系(ReiCells)生产。使用无血清CD293培养基在scale-X hydro生物反应器中进行细胞生长和病毒生产步骤。将得到的实验结果与摇瓶对照工艺进行比较，以评价其成功与否。 

在本案例研究中，在scale-X hydro中接种ReiCells，将含有1.5 × 10⁷ 细胞的750 mL接种液转移到生物反应器中，以批次模式进行生物反应器培养72 h - 96 h。接种后以批次模式进行生长阶段培养，持续24 h，从第2天开始进行循环 (根据工艺情况，持续时间为1或2天)。感染前进行培养基置换。以MOI 200进行感染，随后根据工艺情况，进行3或4天的病毒生产阶段。在生产阶段结束时，使用确定的裂解缓冲液，对细胞进行化学裂解。相同的步骤应用于使用摇瓶进行的对照工艺，细胞生长和病毒生产阶段持续3天，从而形成一个6天的工艺。本研究中应用的关键工艺条件如表1所示。

分析

通过从生物反应器中提取无纺布固定床织物取样条来定量测定细胞密度。用酶解法分离取样条上的细胞并裂解，用结晶紫进行细胞核染色，用血球计计数。采用实时PCR法进行病毒滴度检测。  

表1：工艺条件

图4：使用scale-X hydro系统进行的腺病毒生产步骤流程图

悬浮工艺转移和适应

研究评估了scale-X hydro生物反应器中三种不同的条件。第一个工艺设计为直接的工艺转移，使用与在摇瓶中开发的相同的工艺条件。之后两个工艺设计用于评估工艺参数对细胞密度以及特异性产率的影响。目标和工艺参数总结如下：

工艺#1：直接工艺转移

本工艺将摇瓶的对照工艺直接转移至scale-X hydro生物反应器，评估细胞的增殖速率以及捕获效率。

工艺参数：

◀ 接种时细胞密度：1.5 x 10⁴ cells/cm²

◀ 感染时间：3 天后

◀ 生产持续时间：3 天

工艺 #2：提高生产阶段的持续时间

本工艺评估了生产阶段的持续时间是否可以延长至3天以上，或在这段时间之后，产率是否会趋于稳定。  

工艺参数：

◀ 接种时细胞密度：3 x 10⁴ cells/cm²

◀ 感染时间：3 天后

◀ 生产持续时间：4 天

工艺 #3：感染时更高的细胞密度

本工艺评估提高感染时的细胞密度是否对病毒滴度有影响。  

工艺参数：

◀ 接种时细胞密度：3 x 10⁴ cells/cm²

◀ 感染时间：4 天后

◀ 生产持续时间：3 天

结果和讨论

细胞生长

细胞生长结果表明，悬浮细胞已成功适应固定床结构(图5)，并获得了类似于摇瓶的细胞生长趋势。scale-X hydro生物反应器中的细胞密度在3 - 4天内达到了更高的水平。 

相比摇瓶中的细胞倍增时间(62 h±12 h)，scale-X生物反应器中的倍增时间更快且更可重复(42±1.5 h) (图6)。这可以归因于这样一个事实，即scale-X hydro生物反应器中固定床的结构化设计在接种后提供了均匀的细胞分布，通过间隔层的低剪切培养基液流为生长阶段的细胞提供了适当的营养。这种均匀的环境结合环境控制 (pH和DO) 对细胞生长有积极的影响。

图5：基于scale-X hydro (n=3)的总细胞生长趋势，感染时间为第3天或第4天，对照工艺为摇瓶，感染时间为第3天 

图6：摇瓶和scale-X hydro生物反应器工艺的细胞倍增时间比较

本案例研究中获得的细胞生长结果表明，scale-X 固定床生物反应器可用于悬浮细胞培养，仅需要极少的工艺调整。工艺#3中获得的细胞生长趋势 (3 x10⁹ 总细胞) 与在其它研究中使用scale-X hydro生物反应器获得的贴壁细胞结果 (3.6 x10⁹总细胞) 相当，表明结构化固定床中的细胞捕获对于悬浮细胞和贴壁细胞同样有效^[2]。

病毒生产

细胞生长阶段结束后，固定床中捕获的ReiCells用腺病毒载体感染。在生产阶段采用不同的策略来提高腺病毒滴度。工艺 #1与摇瓶工艺没有任何变化，细胞生长3天，感染后3天。对于工艺 #2和 #3，分别评估了更长的生产阶段时间或更长的细胞生长阶段时间 (感染时更高的细胞密度)对病毒生产的影响。  

图7显示了从工艺# 1到工艺# 3执行的工艺调整，使病毒滴度有了相当大的提高。 

腺病毒通常在感染后3天生产。将生产阶段增加到4天(工艺# 2)的尝试使病毒颗粒总数比初始工艺(工艺# 1)提高了8倍。延长生产阶段有利于所能获得的颗粒数，因为生产没有达到平稳期。  

对于工艺# 3，为了在感染时达到更高的细胞密度，细胞在4天后被感染，随后是3天的生产阶段。与初始工艺 (工艺# 1)相比，这种策略使感染后第3天的病毒颗粒提高了近7倍。与工艺# 2相比，该工艺降低了细胞外病毒的比例(图7)。细胞外病毒的减少预计将降低工艺体积，从而简化下游步骤。

在特异性病毒产率方面，相比摇瓶，scale-X hydro生物反应器显示了约55,000 VP/cell 的增长，相应的特异性产率提高2倍 (图8 - 工艺# 3)。

图7：scale-X hydro生物反应器中，感染后的腺病毒动力学

图8：scale-X hydro生物反应器中，细胞外和细胞内病毒百分比的比较

图9：Scale-X hydro生物反应器和摇瓶中的病毒产率

更高的产率是scale-X hydro生物反应器设计的结果，其通过均匀的细胞分布、低剪切培养基液流以及pH和DO监测与控制，提供了一个支持细胞生长^[3,4]和活性的环境。  

大规模生产

结构化固定床设计实现了类似的体积/表面比和kLa，便于简单且可靠的工艺规模放大。这一特点也有助于从小规模开发到商业化规模的工艺预测。在本研究中获得的初步实验结果表明，在scale-X nitro生物反应器(600 m²)中的大规模产能将相当于2,000 L 搅拌罐生物反应器。  

Scale-X nitro生物反应器可集成到NevoLine™上游平台中，在3 m² 占地面积内实现上游和中游操作的自动化、连续工艺。与悬浮搅拌罐生物反应器相比，在NevoLine 上游平台中执行商业化规模工艺，将大大降低占地面积，因为消除了单独的单元操作和储存步骤。 

图10：带600 m² scale-X nitro生物反应器的NevoLine上游平台，用于集成和连续商业化规模生产 

总结和展望

本案例研究证明在摇瓶中开发的基于悬浮培养的工艺可成功转移和适应scale-X hydro结构化固定床生物反应器，以用于生产腺病毒COVID-19候选疫苗。这突显scale-X技术的双平台能力，即同时适用于贴壁和悬浮细胞培养工艺。  

参考悬浮工艺（基于摇瓶）的直接转移使细胞倍增时间缩短了30%，同时提高了细胞生长的可重现性。通过轻微的工艺调整，使产率提高了2倍。温和的生物反应器微环境有利于在scale-X hydro生物反应器中悬浮细胞的生长，达到与贴壁细胞生长相似的细胞密度。

考虑到可规模放大至scale-X nitro 600 m²，以进行商业化规模生产，加上更多的工艺优化步骤，相比2,000L 搅拌罐生物反应器，可帮助降低占地面积和培养基体积，同时解除产能限制。工艺体积的降低不仅有利于成本，而且有利于工艺优化，因为它可以直接清理下游工艺步骤及其约束。在商业化规模上，转向双平台，可使病毒制造商能够适应悬浮和贴壁工艺要求。  

致谢

Univercells Technologies团队非常感谢Reithera和Exothera的团队分享使用Univercells Technologies的scale-X hydro生物反应器系统进行的研究的工艺细节和实验结果。

参考文献

[1] Univercells Technologies; 4DMT, «Case study for an adeno-associated virus-based gene therapy», Univercells, 2019.

[2] Univercells Technologies; Momotaro-Gene, «Proof of concept for scalable HEK293 cell growth and adenovirus production in adherent process», Univercells, Brussels, 2020.

[3] Univercells Technologies; S.A., Univercells, «Proof of concept for scalable and homogeneous Vero cell growth», Univercells Technologies, Brussels, 2020.

[4] H. M. Leinonen, S. Lepola, E. M. Lipponen, T. Heikura, T. Koponen and N. Parker, «Benchmarking of Scale-X Bioreactor System in Lentiviral», Human Gene Therapy, vol. 31, 2020.

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